实验室日常小技术集锦

平常在实验室最常听到的一句话就是“今日某某实验没做好是为什么？今日某某实验没出后果是什么起因？今日某某实验为什么会是这样的呢？” 等等。而后细心一查找起因，往往是因为操作上面的不细心，或是一些小小的细节没有注重到。以下是集各路冤家的一些经历，与大家分享：
1跑page胶的时分，小电压跑会避免高电压发作的热量尔招致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些，且分别后果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分别。
2。 提取质粒的时分，最后一步的酒精挥发很症结，基本上是其后续的酶切反映的抉择性因素。所以这一步尽量挥发长一点时光，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时光，我试过室温过夜，酶切很好。
3。 做WESTERN BLOT 的时分，大家往往会探究一抗、二抗的浓度，关闭时光，曝光时光等等，而每次变换其中的一个条件就须要从新跑胶、转膜，甚至从新提蛋白，这样会糟蹋大批的时光。其实完整没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，扩充成小块，保留起来，用的时分取出一块，没有任何影响。这关于探究条件的战友来说，勤俭了大批的时光。
4。 有关缓冲液和造就基配置
1）将缓冲液配方中的成分分手以10－100倍配成母液贮存，须要的时分只要将相应的母液混杂，补加水浓缩即可
2）配造就基时通常会忘却各成分的量，如配LB时的三个成分不记得究竟哪个是5g，哪个要10个，因而可以在罕用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配LB时，在NaCl瓶外注明10g÷L， yeast 5 g÷L， tryton 10 g÷L等，很不便，不须要每次配之前暂时翻书
5。 有关PCR主反映液配置：

在做克隆鉴定的时分常常须要在酶切鉴定行进行PCR鉴定，每次配置PCR反映液很繁琐，可以将其配置相似kit的情势，按你须要的反映系统列表，而后减少100倍配置100×主反映液（100次反映），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，而后可以10×分装或一管贮存在－20度，在须要的时分拿出融开，而后按所需的PCR反映个数汲取相应的倍数，再补加相应反映倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的益处如下：

1）可极大的节俭珍贵的时光，可早点出工，看球
2）避免每次反映加样不均的可以
3）大大增添PCR假阳性的发作
6。 有关酶切反映液的配置：

在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反映液，每次反映前先列好反映的系统，算好须要的反映数，而后按所需反映的系统按所需反映数减少，参加buffer、酶、水，质粒栏空缺，而后混杂后按除质粒DNA的体积分装，而后再在每管中参加相应体积的质粒DNA酶切，这样做的益处如下，特殊是当同时有10几个阳性克隆须要鉴定时尤为显著：

1）各反映成分均一
2）可大大增添限制型内切酶的应用
3）节俭时光
7。 有关SDS－PAGE：

1）可将SDS－PAGE的积层胶，分别胶事后配好大体积如100ml贮存在4度冰箱（注：10％AP，TEMED不加，切记！！！），每次配置时只要汲取相应体积的预制胶参加AP，TEMED即可，没必要每次制胶时分翻分子克隆，特殊不便，而且，这样的预制胶可贮存半年以上，不失为偷懒的绝佳方式；更症结的是可大大增添与丙稀酰胺的接触，因而大大增添中毒的时机。

2）电泳时尽管小电泳分别后果要好一些，但2小时以上的期待的时光真实是苦楚，因而可以进步电泳至150V，但须要将全部电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热，这样跑出来的胶分别后果丝毫不比低电压来的差，症结是时光大小节俭，不需1h即可看后果了
8。 实验中小诀窍我想可以分红两类：一类是“非惯例”操作；一类是惯例操作历程中一些省时省事手腕。
前一类，我举个例子：有时分第一天涂的转化平板、次日凌晨转化子可以长成的菌落对比大（1~2毫米以上，BL21就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。这个状况下可以间接挑取一块菌苔（勿带出造就基），50微升酚÷氯仿悬浮菌体，搁置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，汲取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以间接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的造就步骤，至少节俭6~8小时的时光。然而，要在各步骤都控制得很好的状况下能力保障提取和酶切的后果，不同的实验室或许操作者未必可以很不便地反复－－－－其实，其它的一些“小诀窍”也是如此。
后一类的小诀窍则在实验室中无处不在。如：平行作不同样本的PCR，模板DNA加量一样，配置PCR系统可以一起配制后分装－－－－这点做过实验的都晓得，然而配制的时分配制量可以比预期分装量稍多一点（如用100微升则配110微升），这样可以避免有时分分装不够的为难，因为不同特殊是大小不同的枪，会有误差。再比方：楼上有站友说的sds－page胶预配（APS和TEMED、或许后者先不加）的问题，实践上时光搁置过长肯定影响后果，假如要在一天内延续地跑两次板，何尝不可？又比方，配sds－page胶的时分，上层胶和上层胶可以只用一个大枪头：先取胶，次取水，取6。8的tris后再取8。8的tris，省时省料。
20021108站友开的这个帖子很好，在高低层楼的帖子说得也有情理。但我想，“诀窍”和“偷懒”不应当是因果关系。其实，不论是那一类的小诀窍，都是在充足天文解实验各步骤的原理、经过屡次实验积攒、再加上一点点思考而后尝试的后果。知其然知其所以然和勤于思考勇于探究，是基本。否则，他人的小诀窍对你也未必可以有用。才进实验室的老手，务必要先练好标准扎实的操作，而后能力弄“诀窍”。舍本逐末，贻害无限。
9。 我始终是把SDS－PAGE的积层胶，分别胶事后配成mixture，APS制胶时参加，半年内应用，相对没有问题，我保障。
10。 做SDS－PAGE的时分，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，不便前面的对比，特殊是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特殊是上样体积相差较大的。
11。 在把蛋白胶做成干胶时，很多时分会因为有气泡使胶裂掉，我的经历是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不轻易进气泡了，还有就是低温烘胶，我喜爱放到60度烘箱里烘，这样水分蒸发速度快，即便有一些小的气泡也不会有影响，呵呵，这是经历之谈，我素来都没失手过，大家可以试试
12。 做大肠表白时肯定蛋白能否表白个别要煮样做诱前诱后检测，但很多时分煮出来的很黏影响跑胶后果。我发明假如现用8M Urea重悬细菌再煮后果会有极大改良。
注：不能用Gu－HCl替代
13。 我也引荐几个偷懒的方式
1 做SDS－PAGE跑胶通常都是现配现用，但配胶要>1h，所以假如想第二天睡个懒觉而又不延误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分别胶，待凝结后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶槽取下，用保鲜膜包上，注重玻璃板高低两边沿会有气体，所以须要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发。而后放4渡过夜。第二天间接拔下梳子行后续。国外好多公司发售脚既是如此，可以保留上星期。

2 配置分别胶或许非变性胶时因胶凝时压缩可招致加样孔变浅。可以将加剩的胶放入4度以降落凝结速度，而将凝胶放入37度匆匆聚，并随时用4度加剩的胶弥补降落的胶面。另外将胶横放与水立体成~10度角也可以增添压缩的影响。

3 引荐一个勤俭抗体÷时光的做法：
同时跑2块胶，同时转膜，而后两块膜背靠背放入同一封口膜同时关闭，同时一抗二抗（最好是用转轮，这样后果好。假如是摇床，隔一段时光帮它们翻个身以保障两张膜的侧面都有时机与液体充足接触。一起洗膜（可以轻微增强洗膜也可以不做。我最多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜）。可分手或同时压片。这样就可以勤俭一半抗体和靠近一半时光而不会影响后果。
或许另外一个就是孵育后的抗体不要扔，好的抗体可以反复做好几张膜呢。但每次都会削弱，后果不如上面一种方式。
14。做western blotting 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时光，待胶在含有甲醇的缓冲夜中减少的差不多后装恶化膜安装，我的经历是把膜印在胶上间接在膜上画出预染maker条带，不便的很。因为很多时分跑电泳时胶上的预染maker很清晰，等转膜后就不是分手的很清晰了。不过要注重画好预染maker后就不要使胶和膜发作对位挪动了，以防maker失去参照价值。
15。 超滤最适宜用于蛋白的浓缩，改换缓冲液和除盐，关于遵照分子量进行初分别的后果不是很好，实践和现实是有很大区别的^_^
16。 关于Western Blot
1）用具的干净非常首要，开端做前，为了平安，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲刷，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲刷2－3遍，而后用去离子水冲刷一遍。最后用95％酒精再擦一遍后晾干备用。
2）配胶最好现用现配，先配上层胶（分别胶），后配上层胶（浓缩胶或积层胶），而且在临灌胶前加APS并敏捷混匀，即用移液枪抽吸与注入1－2次即可。
17跑蛋白page的时分，一开端用加样针，太费事，发明用20ul枪＋普通小白枪头点，非常省事。另外，点样时有可以看不清孔在哪，看远离你的那面胶，孔有反光的。点样也点你对面的那块胶，省的总抬头，干咱这行的轻易得颈椎呀，顾惜本人。
18。 垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可天然使液面进步而不影响电泳，又很勤俭电泳缓冲液。
19。 咱们有时要积淀货色时，因为积淀量很少，离心完之后不晓得究竟有没积淀下来货色，因为量很少，不好视察，所以离心时倡议按特定的方向搁置离心管，这样你就可以在离心之前肯定积淀该积淀到管子的大抵部位，这样离心后就可间接视察那有没有积淀，避免满管子找，另外看积淀时可以对光看，这样就是颗粒状的渺小积淀也能看见的。
20。 大家都晓得PMSF有剧毒，以前都是晓得浓度和要配的体积的基本上，算出要称多少毫克的PMSF，其实也可以先称PMSF，称多少算多少，再调整异丙醇的体积，抵达你所要的浓度。这样就避免了你长时光和它接触。
21。 跑好SDS－PAGE胶的一些领会。
1。 清洗好玻璃板，不要偷懒，很多时分跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把胶撬破。
2。 配胶时不要反复用枪混，轻微摇混就可以了，用枪混屡次会招致胶凝不好影响电泳图的分手率。
3。 AP分装成500微升一管保留放－20度，避免AP用太久生效。
4。 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓度。
5。 尽量不必过夜放室温或许四度的胶，也回影响胶 的分别后果。
6。 电泳完撬胶时基本不须要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在水中晃动几次胶很轻易就脱落下来，一点没有问题，不便的很。
7。 点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体积淀会影响电泳图分手后果。
8。 尽量在冰浴状况下跑。
22。 做　２－ＤＥ　做的对比多，总结了几个小诀窍：

１．一贯电泳时，盐离子轻易聚在　胶槽的两侧．剪一小段ＩＰＧ胶条放在　　两侧，形成盐桥，电压就轻易上去了．避免一贯电泳不好影响最后实验　　后果．

２． SDS－PAGE时，在灌胶之前，个别大家都会用凡士林封底， 在SDS－PAGE
电 泳之前又必需把凡士林搽干净，很是费事，我的经历是：不必凡士林，取大批未加Ap的分别胶，按比例加2倍量的Ap，而后灌入板间，等上几分钟，待胶凝结后就可以接着灌分别胶了。方面，后果好！
23。 蛋白质纯化时，蛋白质降解可以与超声破菌维持冰浴有关，之前倡议加pmsf，倡议在上柱子洗脱的时分也加pmsf（蛋白降解克制剂），肯定要用之前再加。
24。 做透析的时分，拿一个5ml的枪头或许是其余相似的货色，剪短，穿过个塑料泡沫之类的面积比烧杯大货色，而后把透析带一端扎紧，另一端启齿绑紧在5ml枪头下端，扎紧得那端也可以弯过去绑成u字型。这样就可以用1ml的枪穿过5ml的枪头的孔，另一只手调整透析带，来加样取样，省去了总绑透析带的费事，对同一个蛋白大批屡次透析非常不便
25。 第一次发贴说一下本人的小经历，愿望版主能给我一分，每次看到好货色因为没分都没法下，好爱慕有分的人啊。当然也不能坐享其成，说一下本人的实验技术给大家分享。
1。 配SDS－PAGE胶时，用枪头混匀对比费事，而且费时费劲，后果也不好。可以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里，在磁力搅拌器上边搅边参加各溶液，这样加完也就混匀了，间接灌胶即可。
2。 上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也始终在用，基本不必注射器，不便的很，倡议大家也试试。
3。电泳后考马斯亮蓝染色个别要1h到2h，脱色也要2h左右，费事的很。如今给大家说一个简朴的方式，是我从一个师姐那里学到的。

参加染色液后，先放入微波炉里加热5－10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。而后放程度摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。
脱色也很简朴，不必脱色液，间接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，而后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。后果可以比正常的脱色稍差一点点，不如那样清晰，只要电泳时比平常多上1÷5的样品就可以了，症结是这样省时省资料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。不便快捷！
担心，反复煮胶不会把胶煮坏的。
26。 我也说说我的小经历。可以大家都晓得，请别笑话我。
1、配胶时肯定要控制好时光，不要因为适度赶时光，而形成以后的条带粗大，压不成条带，且消费很多试剂和时光。
2、加样时，冲刷加样器可用双蒸水，用电泳液会使加样器中有很多的泡沫。或许是因为SDS的起因吧？
3、关于大分子蛋白质，转膜过夜更好。滤纸的张数可以恰当增添。
4、在跑样时同时参加MARKER有助于正确辨认所需的蛋白地位，增添NC膜的消费。
5、一抗、二抗的浓度不要太高。
6、做ECL显影时，依据荧光的亮度调整时光。泡完显影液，胶片应用水洗一下，以增添定影液变黄。
7、和有经历的同窗交换，也是非常首要的。常识的交换相对有助于实验的胜利。
这是我目前的一点高见。
27。 引荐一个省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方式：
一切试剂应用手提质粒本人配置的溶液一、溶液二、溶液三（替代试剂盒的solution1、2、3），而后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（替代联合缓冲液）混杂，就可以让质粒在硅胶上联合，而试剂盒的硅胶柱可以反复应用，没有试剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管就提多少。
特地说一句硅胶柱也可以用本人买的硅胶粉末替代，离心后倒掉硅胶柱上面的上清就可以，用起来不象柱子不便。后果比手提的要好要快。
28。 做WB时，样品对比多， 又怕放时光长了对蛋白样品不好，而且肯定以后肯定要做某个抗体，只是一时没有抉择。那么你可以抉择先做SDS－PAGE，并转膜。 而后把PVDF膜凉干， 放四度保留。 以后拿出来关闭后，加抗体就行了。 蛋白在膜上，且已经分别， 比保留在BUFFER外面的蛋白肯定更牢靠。呵呵
29。 今日作his纯化的时分，又推敲了一个诀窍，与大家分享。我得样品对比多，几百ml，而柱子不够大，只要10几ml，跑来跑去的上样，还总得记着，太费事了。于是，我就刷干净了一个烧杯，装了我的样品，找了一个细胶皮管，当连通器，就像鱼缸换水一样，用5ml枪在一头一吸，液体流出来，放到纯化柱里，调好烧杯的地位，两个液面一样平了，呵呵，上了好几个小时了，没有问题，如今调低速度，过夜上样：）
30。 能招致PAGE胶不凝的起因重要有三个：
1、配胶中用到的重要试剂的配置。
重要就是30％的丙稀酰胺的配置。 粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺应用不应当超越一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而招致page胶不凝。
2、温度。
温度高时凝结快，然而亦不宜过高，因为温度变更会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度最为适宜。
3、氧气。
氧气是凝结的终止剂，所以不能让胶中涌现气泡。
尽管都是些看起来听低级的同伴，然而不注重还是会犯。
31。 我做2维蛋白电泳，也有些心得：
1、向电泳玻璃板内参加胶条时，先在缝隙中参加配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴前面玻璃板壁用薄塑料片将胶条慢慢推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。
2、 能做出好的图谱已经很不轻易了，假如在扫图时撕破真实惋惜，所以扫图要警惕，将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在上面托着，同时维持有些水，这样就平安多了。
32。 凑个热烈说两句吧

1、sds－page胶假如配好装好倒入内槽液以后，发明内槽液稍有渗漏，可以把外槽液多加一些，加满，加到与内槽液相齐，这样就可以持续正常跑胶，不必糟蹋已经加出来的内槽液

2、至于染色脱色的问题，咱们这里始终是染色：加热半分钟，摇20分钟；假如染液不是新配的，就加热半分钟摇非常钟，凉透了再反复一次即可
脱色也始终是用去离子水煮两三次即可

3、不晓得大家都是怎样做酶切的，我的领会是，酶切质粒时，两个酶分手单酶切比间接双酶切后果要好很多。我有一次双酶切两次都没连出来，起初分步单酶切，衔接效力简直100％。
可以第一个酶切完后间接把系统热失活，（依据酶解释书上个别是65度20min）而后间接向外面补第二个酶
或许第一个切完后用氯仿抽提，把蛋白提出
或许两头做一次回收，这个就要斟酌回收效力和丧失的问题了，然而这样除蛋白最彻底
前两个方式咱们这都是有人做过的，已经都很好用了
33。 俺也来说说关于Bradford法蛋白浓度定量和DTNB法巯基浓度定量的一点领会：
我是做蛋白润饰巯基后，通过这两种方式的定量来间接反映润饰的程度。一路探究过去，也有半年有余；最大的领会就是不要急于求成，间接实验，首先检测润饰系统能否对方式有影响，润饰基团能否会在595nm和412nm下有特定的排汇，润饰后润饰试剂自身能否会有变更，对蛋白整体结构形成影响，其次再谈详细润饰比例和程度。关于巯基浓度测定方式，有四种（Anal Biochem。 1998 Dec 1；265（1）：8－14），而DTNB自身尽管敏锐度不高，然而反复性和抗搅扰是最佳的了。
34。 考马斯亮蓝染色后的脱色，如在脱色液中加数张捏成条状的Kimwipes纸（国外实验室罕用，相称咱们的擦镜纸，全棉纤维制作），因为染料吸附到纸纤维上，脱色减速。待纸着色较深时，改换新纸条，不必换液。我想脱脂棉或纱布也是一样的。但滤纸等可以不行，会溶掉。

半贴壁细胞如SP÷0或杂交瘤细胞传代时，不必吹打或刮落。先将上清吸出，恰当拍打造就瓶（当然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了别找我），即可见贴壁细胞脱落，加造就基混悬即可。注重，过力拍打造就瓶会裂，特殊是瓶颈。
35。 一贯电泳时，盐离子轻易聚在　胶槽的两侧．剪一小段ＩＰＧ胶条放在　　两侧，形成盐桥，电压就轻易上去了．避免一贯电泳不好影响最后实验　　后果．
36。 我也引荐几条：
1、关于20021108战友的说法，我认为咱们制备好了一批感触态，最好立刻转化一种已知质粒，与此同时，取一点感触态接种到含抗性的固÷液体造就基造就来做对比。这样第二天即可以晓得这批感触态能否还有外源质粒，又可以晓得这批感触态转化效力的高低。假如及格，那以后就可以担心应用！因为我也曾经碰到其实是因为感触态不好而招致实验不胜利，然而事先不晓得，后果费时费劲。
2、做克隆挑斑时，咱们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前，在一块相应抗性的平板上点一下，标注清晰，造就时光稍长一点，待长成较大菌落伍收取。以后须要哪一个菌，就在平板上挑取。这样既不便快捷，又可以保障菌的一致。
3、抽提质粒时，参加Sloution II和III后请求轻柔混匀。我个人认为不必这样，只要不是非常猛烈，可以疾速混匀。尤其可以应用在一次抽提多管质粒的时分，这样可以疾速，而且后果一点也不差。
4、抽提质粒时，用无水乙醇积淀的时光可以由实验操作者来抉择，假如时光富足可以30min，否则8－10min也可以。至于温度，个人认为－20度好于常温。假如参加可醋酸钠，会较轻易形成盐类杂质，所以时光短一些更好！
今日想到这些，先写到这里，以后想到了在下去与大家分享。愿望我的小经历对大家有所赞助！
37。 首先申明：实验中的一些技术要用在首先对基本的操作有深入理解的基本上，在力图省时、省力、勤俭老本等的同时，实验的正确性是最首要的。
对大多数做蛋白的战友们来说，造就细胞应当是不生疏的，我这里谈一个造就细胞的小技术，大家晓得，关于肯定的空间（如某种尺寸的细胞造就瓶）来说，细胞数目太多或许太少都不利于其成长，太多了就要消化，太少了要换一个小点儿的造就瓶，我的做法是：假如细胞数目太少，可以不必去找小一点儿的造就瓶，可把本来的造就瓶由本来的平放改为竖着放，这样底部的空间就小了，有利于细胞的成长，当细胞数目增添到肯定程度的时分还可以在平过去，避免了往返换造就瓶而增添净化的时机（对没有小造就瓶的更实用）。
个人领会，仅供参考。
38。 说说关于SDS－PAGE的几个小经历

1、做好胶后，把一切的加样孔都加上样，这样可以避免边沿的样品脱尾。

2、高电压÷高电流电泳时，可以把电泳槽放到4度冰箱中进行电泳，省时省力，1hr搞定。

3、胶考染时光40min，放在凝胶摇床上（没有胶床可以放到28度普通摇床上，但要控制好摇床速度）慢慢动摇，使染色平均，同时可进步检测的敏锐度，依据我的经历可以达到银染的级别，就是脱色时光对比长，个别须要脱色2－3d，夏天的时分要勤换脱色液，避免变臭哦
39。 质粒小提假如是用作鉴定或酶切，不必进行酚仿抽提，将溶液1。2。3 离心后的清液移入一个新的1。5ml离心管中，再次离心3－5分钟，警惕取出上清液后，间接积淀，不必担忧DNA切不开，我已经这样应用一年多，没出过什么问题。当然这样的质粒不很干净，然而做鉴定足够了。尤其是实验室女同胞们，可以增添酚仿的损害，而且节俭时光。

载自互联网